24
2021
05

烟酰胺单核苷酸(NMN),无毒副作用

 

糖尿病是一种慢性和渐进性疾病,发病率不断上升,对全球卫生保健系统的财政压力日益增大。最近,以2型糖尿病为标志的胰岛素抵抗在用NAD治疗的小鼠中被治愈。+前体β-烟酰胺单核苷酸(NMN),无毒副作用报道。然而,NMN的价格很高,需要更高的成本效益的生产方法。本研究提出了一种生物技术生产NMN的方法。大肠杆菌。表明在烟酰胺(NAM)和乳糖存在下,重组烟酰胺磷酸核糖转移酶(NAMPT)和焦磷酸磷(PRPP)合成酶的双顺反子表达是一种成功的NMN生产方法。携带NAMPT基因的蛋白表达载体杜雷嗜血杆菌和PRPP合成酶淀粉菌L135I突变大肠杆菌BL 21(DE3)pLysS.在添加0.1%NAM和1%乳糖的PYA 8培养基中,NMN产量最高可达15.42mg/L(或17.26mg/g蛋白质)。

根据国际糖尿病联合会的数据,2017年患2型糖尿病的成年人人数为4.25亿,预计到2045年将达到6.49亿。在全球范围内,12%的医疗预算(或7,270亿美元)用于治疗糖尿病。最近的研究将2型糖尿病的标志胰岛素抵抗与线粒体功能下降和NAD降低联系起来。+水平以及NAD+/NADH比值,在老化过程中也观察到1。NAD+存在于所有生物中,是一种众所周知的氧化还原反应辅酶。2,3,4,5。NAD+依赖蛋白去乙酰化酶如SIRT 1和SIRT 6作为代谢传感器,调节下游通路,最终恢复线粒体功能和胰岛素敏感性。6,7,8,9,10,11,12,13。这一发现拓展了NAD的研究领域。+对其他与老化有关的退行性疾病的影响,例如:心血管、癌症、关节炎、骨质疏松症或老年痴呆症14,15,16.

β-烟酰胺单核苷酸17是NAD的中间体+烟酰胺(NAM)和焦磷酸磷(PRPP)通过烟酰胺磷酸核糖转移酶(NAMPT)合成的生物合成(EC 2.4.2.12)7,18,19,20,21。耐受性好,长期给药无副作用,可防止衰老相关的生理衰退。22,nmn是治疗高脂饮食引起的2型糖尿病的有效方法。23,通过逆转与衰老相关的线粒体功能障碍24,以及挽救年龄相关的神经干细胞下降的影响。25.

NAM通常由NAD所涉及的酶转化为NMN。+救助途径,如NAMPT11。这种酶的作用是主要的NAD。+细胞合成活性4。哺乳动物或微生物的核苷酸代谢和生物合成的调节通常通过消耗PRPP来进行。26。核糖-5-磷酸通过戊糖磷酸途径的氧化分支和非氧化分支产生。27,28,29.

在细菌中,NAM最常被烟胺酶转化为烟酸(NA),它整合在Preiss-Handler途径中,这也是大肠杆菌30。在哺乳动物中,烟酰胺酶的活性未见报道;NAM由NAM的一种磷酸核糖转移酶酶转化为NMN。4。虽然大多数细菌缺乏NAM磷酸核糖基转移酶,但该酶在杜雷嗜血杆菌31,32和[医]雪旺氏菌33,34.

简单的、具有代谢功能的有机体,如大肠杆菌,在生物技术中常被用于控制表达具有所需酶活性的蛋白质。这类酶的dna编码经常通过novagen的pet系统等表达载体引入细菌中。35,36,37。宠物载体在表达t7 RNA聚合酶的细菌中转化,如E. 大肠杆菌BL 21(DE3)。酶的表达控制是通过拉茨启动子,它只在乳糖(也被代谢为碳源)或其合成结构类似物异丙基-1-硫代-D-半乳糖苷(非代谢,在生长过程中浓度恒定)的情况下启动表达。38。由于细菌代谢是多才多艺的,碳源的变化39培养基中添加酶底物的浓度是生物工艺过程中需要考虑的关键因素。

针对目前NMN存在的高价格问题,提出了一种从细菌细胞中分离纯化NMN的方法。40。对于进一步的工艺优化,我们只能找到一种酵母生产方法。41,本研究提出了一种简单、经济的nmn生物技术生产方法。大肠杆菌.

结果
细菌转化
由NadV产生的多个氨基酸序列比对杜雷嗜血杆菌、NadV、[医]雪旺氏菌MR-1和NAMPT[医]肌肉,具有很高的相似性(图二)。沙一),使所有这些酶成为生物工艺过程的候选酶。

转化E. 大肠杆菌PET28a(+)质粒携带nadV(NAMPT)基因的细胞在加卡那霉素的LB琼脂平板上形成集落。接种未转化细菌的平板上未检出菌落。从这些菌落中分离到的质粒dna经琼脂糖凝胶电泳证实有nmpt-pet28a、pET28a-sonadV或pET28a-hdnadv质粒。E. 大肠杆菌DH5α(附图)S2A、2号、3号、4号车道)。DNA条带与E. 大肠杆菌BL 21(DE3)pLysS细胞(附图)S2A,第6、7、8条),用相应的质粒直接从E. 大肠杆菌DH5α.未转化E. 大肠杆菌BL 21(DE3)pLysS细胞作为阴性对照,经电泳证实pLysS质粒的存在,其长度为4886 bp。S2A琼脂糖凝胶显示。

转化菌的生长曲线
耐受性钠离子浓度的测定
从生物技术的角度来看,来自pET28a(+)质粒的nadV(NAMPT)基因产物或用作NMN前体的NAM基因产物是否对细菌细胞有毒性,使培养物在生物合成过程中无法达到高密度。

在添加不同NaM浓度(0.1%、1%、5%)的培养基中,转化菌株和未转化菌株的生长曲线见附图。S3。添加0.1%NaM和1%NaM的Lb肉汤对生长没有完全抑制作用。然而,当使用5%的NaM时,生长速率显著下降(附图)。S3C、图1.1)。用最低的NaM浓度(0.1%),pET28a-soNadV(OD)转化的细菌细胞的光密度最高。600 Nm>1.3),1%的NAM耐受性好(OD)600 Nm在摇瓶培养中达到1。S3A).

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